Totally Spies raconte les aventures de trois amies : Sam, Clover et Alex. Les trois amies vivent en banlieue de Los Angeles, Californie, et étudient au lycée Beverly High de Beverly Hills (saison 1 à 4) puis à la fac de Mali-U (saison 5). Étudiantes dans la vie de tous les jours, elles sont en réalité agents secrets, c'est-à-dire des espionnes professionnelles qui travaillent pour le WOOHP (World Office Of Human Protection), une organisation secrète de protection de l'humanité, situé dans le centre-ville de Los Angeles. Elles adorent faire leurs shopping au Groove ou sur Rodeo Drive. Lorsque leur patron, Jerry, a besoin de leurs services, il les envoie en mission, après leur avoir fait revêtir des combinaisons intégrales moulantes en latex coloré (jaune pour Alex, rouge pour Clover, vert pour Sam alors que Mandy qui était devenue espionne par hasard avait une combinaison mauve) et leur fournit divers gadgets, qui les aideront à mener à bien leurs enquêtes. Les héroïnes sont des jeunes filles modernes, indépendantes et sophistiquées, enthousiastes à la fois des aventures périlleuses et du maquillage et de la mode.